1. 质粒电泳，质粒酶切的纯化方式会影响连接吗？
需要，被切掉的部分同样带有粘性末端（因为粘性末端的碱基互补），会干扰目的片段与载体连接。
如果不想用胶回收方法纯化，可以选择吸附柱过滤除掉被切掉的小分子片段。胶回收纯化的好处是直观的判断酶切实验结果是否理想，是否酶切完全，胶回收可以避免收集不完全酶切的质粒片段（包括完整的环状质粒和线性质粒）等等。质粒，目的基因酶切后，酶切液琼脂糖凝胶电泳，将含目的条带的凝胶切下来，进行胶回收，然后再在连接酶的作用下，4度和16度都可以（看你的目的基因的情况决定），将目的基因与目标质粒连接在一起。
2. 一般碱裂解法提取的质粒在琼脂糖凝胶电泳中会出现几条带？
一般碱裂解法提取的质粒在琼脂糖凝胶电泳中会出现3条带。据推测跑在最前边的是cccDNA(共价闭合环)，中间的是OC(开环)，最后的有点拖带，稍宽。
3. 如何判断提取的质粒的质量和纯度？
判断提取的质粒的质量和纯度的方法：
直接用环状的质粒跑电泳是很难判断其分子量的
一般来说要先找到上面的一个相应的酶切位点（这个酶在这个质粒上只有一个识别域）.把质粒完全切开后再跑琼脂糖凝胶电泳,配合适当的marker就可以比较准确的判断质粒的分子量.
有问题一起讨论解决哦~
4. 质粒提取的步骤？
质粒的提取步骤
1. 取通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管，6000-8000rpm离心1-2min，尽量去上清（看菌长的情况怎么样，一般会养多的，所以低速离心，多丢掉点上清乃至混有上清的菌体也没关系，浪费就浪费了）；
2. 取冰盒，放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer，在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer，并用移液枪打匀（低速其实就是为了方便三下就迅速打匀，高速离心有轻微伤害，且打匀稍微费点劲而已）；
3. 再加入250μl的P2 buffer，温和地上下颠倒5-10次混匀，会有黏液状出现（像果冻一样，注意不要剧烈震荡混匀，有损伤，且可能导致基因组DNA断裂污染质粒，完全可以不静置，裂解时间长了有损伤）；
4. 迅速加入350μl的P3 buffer，再轻柔地上下颠倒5-10次混匀（迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突，剧烈震荡有损伤）；
5. 有白色絮状或块状出现，12000rpm离心5-10min（这里可以高速一下，免得吸取上清把蛋白等吸进去了，所以，吸取干净的上清就行，和之前一样，浪费了一些就浪费了，不要执着全吸走，我们要质量高的质粒，而不是要多的质粒）；
6. 转移全部上清液到吸附柱，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（这里最好低速离心，充分让吸附柱吸附，所以看吸附柱情况调整转速和时间）；
7. 加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（同上，低速慢慢洗）；
8. 重复7步骤再洗两次，如果要去除盐类，可以停留1-2min再离心（加洗液）；
9. 空柱12000rpm离心3-5min（这里一定要高速离心，去掉吸附柱里的残留液体，主要是酒精）；
10. 转移吸附柱到1.5ml新EP管，常温或加热开盖放置15-30min，挥发干净剩余酒精（也别太高温或者时间太长，没酒精味道就行）；
11. 轻轻加入65℃，40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央，静置2min，再12000rpm离心30s-1分钟，留清液（一般，我们用去离子水就好了。免得后续质谱什么还收到残留胍盐影响）；
用Nano drop 2000 测量DNA含量，符合要求则进行下一步的比如电泳验证，酶切等实验。
5. 为什么超螺旋DNA移动最快？
DNA分子特性和电泳条件。⑴DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。⑵DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。⑶不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。⑷电场强度⑸溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。⑹电泳缓冲液
6. 环形质粒和线性质粒哪个跑得快？
线性DNA的电泳迁移速率比开环质粒DNA快。 一、详细讲解如下:
1.
琼脂糖凝胶电泳DNA 迁移速率与分子大小和构象相关,分子构象越大,摩擦阻力越大,第一条带是超螺旋带应该最亮,因为超螺旋结构完整紧密,跑得最快。
2.
第二条带为线性质粒是双链都断开变成松弛的线性DNA,不如超螺旋紧密,跑得相对慢 。第三条带为开环质粒,DNA双链的其中一根断开,导致超螺旋能量被释放而使质粒变成松弛的环状结构,结构臃肿,跑得最慢。
3.
由于摩擦阻力的问题,琼脂就像有孔海绵分子筛,细菌质粒提取中电泳会出现三条带,最快的是超螺旋带,它是完整的,因为它的构型紧密,跑得快。
4.
第二条带在中间,是线性带,即环状双链DNA 两条链均断开,其分子构象变为线性,不如超螺旋紧密。
7. 对于载体的单酶切和双酶切？
单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带，而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的。
原因是单酶切形成的粘性末端完全相同，就像拼图，除了内容不同，两边完全切合。所以结合方式过多，可能性也多，如质粒和目的基因正确连接，质粒和目的基因反转连接，质粒和质粒连接，目的基因与目的基因的连接。双酶切一般会有3条带，而且正确现象应只有一个是非常亮的。因为两种酶识别两个位点切开，无论是质粒还是目的片段两端的粘性末端完全不同，还是拼图，内容不同，两端切合口也不同，除了一种连接方式外没有其他连接了。胶途中3条带分别为：目的片段条带，空质粒条带，最亮的重组质粒条带。
